Actualização sobre SCA3

O seguinte artigo foi apresentado no Encontro Anual de Membros da NAF 2005, em Tampa, na Florida

Dr. Paulson é professor de neurologia na Universidade de Medicina de Iowa Carver, em Iowa City. Recebeu o seu doutoramento em Biologia Celular na Universidade de Medicina de Yale. Depois completou um estágio em Neurologia na Universidade da Pensilvânia, seguido de um pós-doutoramento em Neurogenética e Doenças do Movimento. Em 1997, juntou-se á Faculdade de medicina na Universidade de Iowa, onde foi promovido a professor associado em 2005.
A pesquisa de Dr. Paulson relacionava-se com as causas e tratamento de doenças neurodegenerativas incluindo as ataxias cerebelosas. Um particular interesse na doença de Machado-Joseph (também conhecida como SCA3) e desordens relacionadas com a poliglutamina.

Dr. Paulson co-dirige o Centro de Excelência da Doença de Huntington e serve os quadros de aconselhamento científico de numerosas organizações nacionais relacionadas com a doença. Recebeu vários prémios, e é semifinalista da Fundação de Pesquisa Médica W.M. Keck. Baseada na SCA3/DMJ, no seu laboratório foi fundado um Projecto de Pesquisa da DMJ.

Agradeço-vos, mais uma vez, a oportunidade de falar a vós este ano com uma actualização sobre a ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA 3), também conhecida como doença de machado-joseph (DMJ); SCA3 e DMJ são nomes para a mesma doença. Chamarei a esta doença SCA3 apesar de DMJ ser o seu nome original, igualmente legítimo.
O último ano foi um bom ano na pesquisa para a SCA3. Pelo menos 32 artigos foram publicados em 2004 directamente relacionados com a SCA3 (e actualizados em 12/01/05: pelo menos, mais 29 desde então). Alguns dos maiores avanços feitos nos últimos 12 meses em SCA3 foram:

1) Sabemos um pouco mais sobre o tamanho da mutação; 2) o papel da proteína relacionada com a doença está a chegar a uma melhor clarificação; 3) RNAI continua a ser estudada como uma potencial forma de terapia e 4) um novo modelo de rato foi desenvolvido como tendo um fenotipo neurodegenerativo. Por outras palavras, este novo modelo de rato (desenvolvido pela Dr.ª Verónica Colomer e colegas) tem mudanças neuropatológicas e de comportamento que podem servir como uma ferramenta poderosa com a qual se poderão levar a cabo alguns dos mais básicos estudos biológicos e pré-clínicos precisos para a pesquisa em SCA3. Existem outros modelos de rato SCA3, de momento impublicáveis (pelo menos não tenho liberdade de falar neles), que também parecem ter um fenotipo claro.
Neste discurso, focarei primeiramente as propriedades da proteína da doença SCA3, conhecida como ataxin-3, cujas novas evidencias apontam para que possam ter um intrigante papel no controle da qualidade da proteína. Irei também focar a interferência RNA (RNAi) desde que este tópico interesse a muitos de vós. RNAi como uma aproximação ao gene “tóxico” em SCA3 ou outras ataxias dominantes parece ser uma potencial estratégia terapêutica. Precisamos, no entanto, de estar conscientes que os cientistas têm ainda muito trabalho a fazer antes que o RNAi para a SCA3 possa ser utilizada em testes clínicos.

Para aqueles que não conhecem a SCA3, é importante que eu dê pelo menos uma ideia. A SCA3 é uma das mais comuns, senão a mais comum, ataxias dominantes. Mais do que as restantes ataxias dominantes, a SCA3 pode manifestar-se de várias formas no que diz respeito a sinais e sintomas e á sua intensidade. Em adição á ataxia e problemas no cérebro, pode haver espasticidade, neuropatia e, em algumas pessoas afectadas, sintomas da doença de Parkinson.
É importante enfatizar que esta é uma de nove doenças neurodegenerativas que partilham do mesmo tipo de mutação: a normal repetição CAG no gene da doença torna-se expandida. Como a normal repetição no gene normal, esta repetição expandida repete códigos para o aminoácido da glutamina na proteína desta doença. O tamanho da glutamina é simplesmente maior na proteína da doença do que na proteína normal. Então, estas nove desordens são frequentemente chamadas de doenças da poliglutamina expandida. Seis das Nove doenças são ataxias espinocerebelares dominantes (SCA 1, 2, 3, 6, 7 e 17); as outras três são também neurodegenerativas e diferem clinicamente das SCA`s. (As outras doenças são a doença de Huntington, a desordem neuro motora que é a doença de Kennedy, e a DRPLA, que diferem das restantes ataxias.)
Em todas estas nove doenças, a proteína expandida (isto é, a causadora da doença) acumula-se de modo anormal dentro das células do cérebro. Um sinal desta acumulação anormal é a formação de corpos que se incluem em alguns neurónios. Estas inclusões contêm a proteína da doença assim como outras proteínas incluem a pequena proteína modificadora, ubiquitina. Porque destaquei a ubiquitina? Porque a proteína ataxin-3 tem uma função altamente conservadora que os cientistas reconhecem como tendo uma função relacionada com a remoção da ubiquitina que vem acoplado ás proteínas. No extremo oposto, a ataxin-3 tem domínios muito mais pequenos responsáveis pela ligação com a ubiquitina.

Então o que é a ubiquitina? Ubiquitina é uma proteína muito pequena, com um sexto do tamanho da ataxin-3, que já por si é uma proteína com um tamanho médio. Mas a função da ubiquitina nas células não é pequena. É muito importante para a célula, onde participa no controlo de qualidade da proteína. Através da acção de enzimas específicas, a ubiquitina vem acoplada a proteínas maiores. Depois que as proteínas sofrem a acção da ubiquitina, são frequentemente marcadas para destruição. Toda a proteína feita na célula tem um tempo de vida, algumas vivem muito tempo enquanto outras são rapidamente destruídas. De facto, em alguns mecanismos celulares, manter uma proteína específica é tão importante como fazer novas proteínas.
A maior forma de destruição das proteínas nas células é através de um largo complexo de proteínas chamadas de proteassoma. A proteassoma pode actuar dentro da célula dividindo-a em pedacinhos. De maneira a que a proteína seja enviada para a proteasoma para degradação, habitualmente tem de haver um canal de moléculas da ubiquitina acopladas. Por outras palavras, um ou mais canais de ubiquitina é conjugado á proteína.
Depois que esta proteína sofre a acção da ubiquitina e é entregue á proteassoma, os canais de ubiquitina são removidos da proteína antes que a proteassoma os desgaste. Então, novos focos de ubiquitina podem ser reciclados para o mesmo propósito. A ubiquitina obedece a outros papéis na célula muito complicados para abordar aqui. Suficiente para dizer, no entanto, que a ubiquitina e as enzimas que o adicionam ou removem são peças vitais para a elaborada maquinaria da qualidade das proteínas que existem nos neurónios. A Ataxin-3 é, então, uma das proteínas designadas para remover a ubiquitina das outras proteínas.

Isto é interessante porque na SCA3 e outras doenças da poliglutamina, a evidência sugere haver alguns problemas no controlo de qualidade da proteína, em particular na sua degradação. Há também fortes evidências genéticas de que esses componentes específicos que contribuem para a maquinaria do controlo de qualidade nos neurónios pode modular doenças, pelo menos em modelos animais e celulares. Estamos a começar a suspeitar que a proteína da doença, ataxin-3, está também aqui envolvida. Uma das coisas importantes a reconhecer é que, além de ter problemas de degradação nas proteínas através da ubiquitina, a célula também precisa de atravessar os canais da ubiquitina adicionados á proteína e reciclar a ubiquitina para uma variedade de propósitos. È preciso que haja um caminho para retirar a ubiquitina das proteínas e reciclar, senão seria muito mau para a célula do ponto de vista energético. É aqui que a ataxin-3 funciona, removendo a ubiquitina das proteínas e reciclando-as.
Este conhecimento advém do trabalho de muitos laboratórios usando uma variedade de técnicas. Por exemplo, nós e outros purificámos a proteína ataxin-3 e incubámo-la com diferentes tipos de canais de ubiquitina. Neste tipo de processo, a ataxin-3 prefere percorrer longos canais de ubiquitina, não moléculas individuais do mesmo. Se nós procedêssemos á mutação da parte da ataxin-3 que liberta a ubiquitina das proteínas, as proteínas «ubiquitinadas» acumulavam-se na célula porque a ataxin-3 já não seria capaz de as libertar. A pesquisa incide agora nos substratos principais da ataxin-3.
Qual é a importância desta nova descoberta para a fisiologia da célula e para a doença humana? Actualmente o nosso modelo é o de que a ataxin-3 une os canais de ubiquitina acima de um tamanho particular – maior parece ser melhor – e depois prepara esses canais. Pode até preferir ajustar a ubiquitina a tipos particulares de canais, sendo que isto é um trabalho em progresso. Quais são os alvos das proteínas que normalmente actuam na célula? E quando a repetição da glutamina é expandida na proteína (isto é, a causa da mutação na SCA3) como é que isso afecta esta função normal? Estas são questões a que o meu e outros laboratórios estão a tentar responder, através de experiências no tubo de ensaio, em células e em ratos.
Como um primeiro passo no sentido de percebermos como é que a função da ataxin-3 pode estar relacionada com a doença, procurámos o nosso colaborador, Dr. Nancy Bonini, um talentoso biologista da Universidade da Pensilvânia, pioneiro no uso da Drosofila (mosca da fruta) em modelos de doenças da poliglutamina. Apesar das moscas não se parecerem muito com os humanos, nós partilhamos a mesma máquina genética e maquinaria celular. Então, modelar a doença na mosca é um caminho poderoso para identificar genes e soluções que contribuem para a descoberta da génese da doença.
Quando Dr. Bonini e os seus colegas expressaram o fragmento de poliglutamina na ataxin-3 expandida no olho ou cérebro, houve uma rápida e massiva degeneração. Os fragmentos de ataxin-3 provaram ser altamente tóxicos. Em contraste, quando expressaram a proteína da doença em toda a sua extensão, com uma ainda maior poliglutamina, isso causou uma incrivelmente lenta e suave degeneração. Foi quase como se as funções biológicas da ataxin-3 contrariassem a toxicidade intrínseca da poliglutamina expandida. Insistindo nesta ideia, quando a ataxin-3 normal foi expressada na mosca, isso suprimiu marcadamente a toxicidade causada pelas proteínas da poliglutamina expandida. Espantosamente, até a ataxin-3 expandida reteve alguma habilidade para contrariar a toxicidade de outras proteínas de doenças. Uma importante pista para o mecanismo de suprimir a toxicidade é a actividade relacionada com a ubiquitina. Se, por exemplo, a actividade da ubiquitina na ataxin-3 é interrompida mudando um único aminoácido, esta actividade de supressão está completamente perdida, e a ataxin-3 expandida torna-se extremamente tóxica para a mosca.

Esta descoberta sugere que a ataxin-3 serve tipicamente para uma «boa» função no controlo de qualidade da proteína, o que só acontece para contrariar a má actividade que acontece quando o domínio da poliglutamina se torna expandido. De acordo com isto, a ataxin-3 parece tolerar a expansão larga melhor do que a maior parte das outras proteínas de doenças da poliglutamina (por exemplo, uma repetição de 55 a 60 causa uma relativamente leve e tardia progressão da SCA3 mas causará uma progressão muito mais antecipada em muitas outras doenças da poliglutamina). Claro que o que é verdade na mosca pode não ser no caso dos humanos. Actualmente estamos a falar em prosseguir com os nossos estudos para o passo seguinte, tentando confirmar a descoberta em moscas e em ratos modelos da doença.
Um resumo da história da função da ataxin-3, até agora, pode ser este: se pensam na ubiquitina como sendo muito importante para o controlo de qualidade da proteína, a ataxin-3 parece ser um modelador destes caminhos nos quais a ubiquitina é tão importante. De modo impressionante, estes mesmos caminhos já estiveram implicados na doença. Temos muitas mais importantes questões para responder, incluindo: será que este conhecimento começa a dizer-nos quais os caminhos biológicos que podem eventualmente levar a uma terapia? Apesar de estarmos longe dessa possibilidade, estamos certamente entusiasmados com o projecto.
O segundo tópico que eu queria tocar é o potencial uso da interferência RNA (RNAi) como terapia. Podemos nós actualmente usar este poderoso mecanismo celular como uma maneira de travar a progressão da doença? Apesar de não entendermos ainda por completo a biologia das doenças da poliglutamina, sabemos que a expansão CAG está relacionada com algum tipo de problema tóxico a nível da proteína. Se pudéssemos eliminar esse problema tóxico silenciando a expressão da proteína, isso poderia ser muito útil do ponto de vista terapêutico. O caminho para produzir uma proteína através do seu ADN azul, vem através de um passo intermédio trazido por um tipo específico de RNA, o chamado «mensageiro RNA» ou mRNA. Eliminando o mRNA da SCA3, seria uma maneira directa de prevenir a produção da proteína tóxica da ataxin-3.A RNAi traz-nos um poderoso caminho para fazer isso.
A RNAi como um caminho para desligar especificamente um determinado gene foi descoberto há apenas uma década, mas foi baseado em tecnologia existente há mais tempo. A ideia é criar uma sequência nucleótida complementar que reconheça um gene em particular (mRNA) e previna a produção da proteína codificada pelo mRNA. Uma chave para a RNAi é que esta tem lugar através de um intermediário RNA duplo. Uma das faces desta molécula RNA dupla é complementar ao vosso mRNA, e esta face vem incorporada a um complexo de proteínas chamado de complexo RISC. O complexo RISC ajusta o complementar mRNA = no nosso caso, será o SCA3 mRNA. Parte do poder da RNAi é que o complexo RISC pode continuar a actuar em outras cópias do mRNA. Isto significa um relativamente pequeno número de complexos RISC podem fazer um muito bom trabalho eliminando o alvo mRNA.
Nos nossos estudos da RNAi, todos os que têm sido feitos em colaboração com o laboratório Dr. Beverly Davidson (também em Iowa), fizemos a abordagem de criar vírus que fizessem as moléculas RNAi suprimir vários genes dominantes que actuam na doença. Estes incluíram vários genes de doenças da poliglutamina como a SCA1 e SCA3. A história é mais completa na SCA1, onde Davidson e colegas tiveram sucesso usando RNAi para níveis marcadamente mais baixos da proteína mutante e abrandar o processo em ratos transgénicos com SCA1. Vamos agora fazer o mesmo tipo de experiências com a ataxin-3, empregando a mesma tecnologia: gerando um vírus combinado que codifique uma pequena porção de RNA, ou shRNA. Esse shRNA então é processado pelos neurónios para o reagente RNAi que pode ser suprimido pela expressão da ataxin-3.
Para possibilitar esta abordagem em humanos para a SCA3, precisamos de novos modelos de ratos com SCA3. Felizmente estes modelos estão finalmente a começar a chegar. Muitas questões têm de ser respondidas e muitos caminhos há ainda a percorrer para que se possa considerar a RNAi como uma potencial terapia. Poderemos nós alcançar uma chegada eficiente e sustentada da RNAi ao cérebro das pessoas? Um cérebro de um rato é muito mais pequeno do que um cérebro humano. Em primatas não humanos com cérebros muito maiores do que os dos ratos, os cientistas obtiveram sucesso na entrega dos vírus a grandes partes do cérebro, mas há ainda mais trabalho a fazer neste objectivo. E qual é a região do cérebro a qual deveremos incidir? Nos ratos com SCA1, onde a RNAi trabalhou com tanto sucesso, a proteína da doença foi engendrada para ser expressa somente nas células Purkinje do cerebelo, então nós sabemos exactamente onde injectar o vírus. Na SCA3, os alvos da doença não são só as células Purkinje mas incluem também outras regiões do cerebelo, o sistema do cérebro e o gânglio básico. Outro importante ponto neste assunto da entrega regular da RNAi. Podemos nós criar um vírus cuja expressão é regulada por uma pequena molécula para que pudéssemos apagar a produção da RNAi no caso de causar efeitos adversos quando entregues de modo crónico a pessoas? E em relação a alternativas, abordagens não virais de entregas, incluindo entregas implantáveis que pudessem ser ou não apagadas?
Finalmente, a RNAi tem lugar através de uma evolutiva e conservada maquinaria biológica que serve importantes papéis fisiológicos em organismos tão diversos como plantas e humanos. Podemos nós actualmente actuar nesta maquinaria biológica existente para apagar um gene doente sem provocar efeitos adversos nalgumas das suas funções normais? São todas questões importantes que precisamos responder. De modo importante, estamos agora numa posição onde podemos responder a estas questões.

Deixem-me terminar dizendo que, apesar de eu desejar que estivéssemos mais perto de uma terapia com drogas para a SCA3, as coisas estão a prosseguir de modo mais rápido do que estiveram há alguns anos atrás. Estou confiante que, o estudo agora tem boas células de base e modelos animais com os quais podemos estar preparados para vislumbrar drogas que reduzem a toxicidade da ataxin-3 expandida e para vislumbrar a RNAi como terapia. Temos, no entanto, muito trabalho a fazer. Um benefício para nós que estamos preocupados com a SCA3: por causa das novas ligações descobertas na ataxin-3 aos caminhos da ubiquitina, um número de muito bons cientistas ficaram certamente muito interessados nesta intrigante proteína da doença. Este brilho adicional, estas mentes criativas só podem ajudar no avanço da causa da SCA3.

Quero agradecer ás pessoas no meu laboratório, e nos laboratórios dos meus colaboradores Nancy Bonini, Bev Davidson, Vernica Colomer, Olaf Riess e Udo Rub, pelo seu trabalho intensivo e ideias espertas.

Font: Generatios Winter 2005-06