"Atrofia cerebelosa cortical" vai encolhendo na era do sequenciamento da próxima geração

Kunihiro Yoshida, Satoko Miyatake, Tomomi Kinoshita, Hiroshi Doi, Yoshinori Tsurusaki, Noriko Miyake, Hirotomo Saitsu e Naomichi Matsumoto

A atrofia cerebelosa cortical (CCA) indica uma ataxia degenerativa não-hereditária de etiologia desconhecida. Esta entidade é muitas vezes referida como atrofia cerebelosa cortical de início tardio, ataxia cerebelosa idiopática esporádica ou ataxia de início adulto esporádica de etiologia desconhecida. O diagnóstico de CCA deve cumprir os seguintes critérios: ataxia progressiva; início da doença depois de 20 anos de idade; nenhuma instalação aguda ou subaguda da doença; história familiar informativa e negativa, ou nenhuma evidência duma mutação genética causadora; nenhuma causa sintomática estabelecida; e não possível ou provável atrofia sistémica múltipla. Em suma, o diagnóstico de CCA deve ser feito por exclusão de causas adquiridas e genéticas de ataxia, bem como atrofias sistémicas múltiplas.

De acordo com a secretaria japonesa de "doenças incuráveis​​" administrada pelo Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão, o número total de pacientes com ataxia espinocerebelosa, excluindo a atrofia sistémica múltipla, eram de 25.477, no ano fiscal de 2012 Com base nos dados publicados por Tsuji et al., o número estimado de CCA é de aproximadamente ~10.000 no presente. No entanto, é muito improvável que esses pacientes preenchessem os critérios de diagnóstico mostrado acima, porque a história da família muitas vezes não era totalmente informativa, e os testes genéticos não eram obrigatórios para entrar no registro. Portanto, acredita-se que a CCA é um grupo heterogêneo de distúrbios atáxicos. Relatórios anteriores indicaram que ~2-20% dos pacientes com diagnóstico de CCA foram confirmados através de testes genéticos como tendo mutações num dos genes causadores de ataxias cerebelosas autossómicas dominantes. Na verdade, 11 pacientes (15,1%) da nossa coorte de 73 pacientes atáxicos sem uma história familiar aparente tinham conhecidas mutações genéticas (SCA6: 3; SCA31: 4; DMJ/SCA3: 2; SCA2: 1 e DRPLA: 1). Além disso, utilizando sequenciamento da última geração, agora é possível identificar variantes causadoras de doenças muito raras.

Recentemente, identificamos uma nova mutação ANO10 num paciente CCA, usando sequenciamento da última geração. Ele era um homem de 66 anos, de nacionalidade japonesa, que desenvolveu instabilidade da marcha e disartria aos 41 anos. A sua mãe e o seu pai faleceram aos 94 anos e 78 anos, respetivamente, mas informações confiáveis ​​sobre a sua consanguinidade não foram obtidas. Ambos foram identificados como não tendo ataxia de marcha ou disartria durante a sua vida. Ele tinha dois irmãos e dois filhos, todos eles não estando afetados. Desde que ele se apercebeu de distúrbios na marcha e na fala, os seus sintomas atáxicos progrediram muito gradualmente. Ele reformou-se do seu trabalho como professor com a idade de 55 anos, por causa da ataxia debilitante. No momento, ele está numa cadeira de rodas e não pode levantar-se sem se segurar a algo por causa da severa ataxia do tronco. Exames neurológicos revelaram aumento dos reflexos profundos com um sinal de Babinski bilateral positivo, além de ataxia cerebelosa. Deficiência intelectual, parkinsonismo ou movimentos involuntários não foram observados. Desperdício muscular e diminuição da sensibilidade da vibração em membros inferiores foram anotados. As imagens da ressonância magnética (RM) aos 64 anos indicava atrofia cerebelosa, mas não do tronco cerebral ou atrofia cerebral (Figuras 1a e b). Lesões anormais de intensidade elevada não foram observadas, tanto em regiões supratentoriais, como em subtentoriais. O teste genético usando ADN genómico obtido de leucócitos do sangue periférico, não revelou quaisquer mutações conhecidas para ataxias cerebelosas autossómicas dominantes (SCA1, SCA2, DMJ/SCA3, SCA6, SCA7, SCA12, SCA17, DRPLA e SCA31).

Figura 1.

As imagens da ressonância magnética aos 64 anos mostram atrofia cerebelosa, sem atrofia do tronco cerebral ou pedúnculo cerebelar médio. O sinal cross bun quente não é observado (a: TR (tempo de repetição) 4.427,49 / TE (tempo de eco) 100; b: TR 4.961,44 / TE 90). Uma mutação modular homozigótica (c.493_494dup: p.Ile166Alafs * 3) no ANO10 é indicada (c).As setas vermelhas indicam duplicação GG no paciente.

Este paciente chamou a nossa atenção porque a consanguinidade de seus pais não era totalmente informativa, deixando em aberto a possibilidade de ele ter uma das raras ataxias cerebelosas autossómicas recessivas. Para explorar ainda mais para a causa genética da sua ataxia, realizamos o sequenciamento completo ao exome. O ADN genómico foi capturado usando um kit v5 SureSelect Humano All Exon (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e sequenciado num HiSeq2000 com 101 bp emparelhado (Illumina, San Diego, CA, EUA). A análise de imagens e chamadas de base foram realizadas pelo software de controlo de sequência de análise em tempo real e software CASAVA v1.8 (Illumina). As leituras foram alinhadas para GRCh37 com Novoalign (http://www.novocraft.com/). Duplicados de PCR foram removidos usando Picard (http://picard.sourceforge.net/). As variantes foram chamadas pelo Toolkit Análise do Genoma (http://www.broadinstitute.org/gatk/) e anotada usando ANNOVAR (http://www.openbioinformatics.org/annovar/) após a exclusão das variantes comuns registradas na base de dados comum dbSNP135 (frequência do alelo menor, maior ou igual a 0.01). A profundidade média da cobertura do sequenciamento completo do exome foi de 92,6 ×, e mais de 93,1% do total de sequência da codificação dos genes RefSeq conseguiu uma profundidade de leitura 20 ×. Obtivemos proteínas de alteração raras e chamadas variantes após a filtragem contra 575 exomes de controlo. Uma nova mutação modular homozigótica (c.493_494dup: p.Ile166Alafs * 3) no ANO10, confirmada pelo sequenciamento Sanger, foi identificada (Figura 1c). A sua condição foi diagnosticada como ataxia espinocerebelosa autossómica recessiva tipo ataxia 10 (SCAR10, OMIM 613728). Esta é a sexta mutação identificada no ANO10 até agora, e este caso é o segundo no Japão após o paciente relatado por Maruyama et al. O nosso caso foi clinicamente bastante semelhante ao seu caso, com ambos apresentando o puro fenótipo cerebeloso de início tardio.

Especulamos que ele poderia ter CCA típica quando veio ao nosso hospital aos 46 anos. Ele cumpria os critérios clínicos para a CCA e os testes genéticos descartavam ataxias cerebelosas autossómicas dominantes conhecidas com as repetições das expansões e SCA31. Agora, a situação mudou. O sequenciamento completo do exome permitiu a identificação de mutações causadoras de doenças raras, mesmo em pacientes aparentemente esporádicos. Portanto, precisamos de chamar a profundidade dos testes genéticos em questão com mais cuidado quando discutimos se o paciente preenche os critérios da CCA. Como o custo do desempenho do sequenciamento da próxima geração está a melhorar, a definição precisa de CCA visando o teste genético está a tornar-se cada vez mais difícil. Um número significativo de pacientes com CCA será provado terem mutações estáticos ataxias cerebelosas autossómicas dominantes raras ou ataxias cerebelosas autossómicas recessivas com esta técnica num futuro próximo, se forem testados. Agora, devemos reconhecer com mais rigor que um diagnóstico provisório de "CCA" inclui muitas causas genéticas diferentes.

Fonte: http://www.nature.com/jhg/journal/vaop/ncurrent/full/jhg201475a.html

Moscas da fruta revelam função normal dum gene mutado na ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7)

Ataxina-7, um dos vários genes associados a doenças neurodegenerativas, âncoras de um módulo chave enzimático para o complexo SAGA da mosca de fruta, que ajuda a controlar a atividade genética em organismos até aos seres humanos. A preparação cromossomática politene da mosca com Ataxina-7 é mostrada a verde, o ARN polimerase a encarnado e o ADN a azul. Créditos: Dr. Ryan Mohan do Instituto Stowers para a Investigação Médica.

As interrupções aglomeradas de proteínas mutantes são muitas vezes culpadas pelo entupimento das células e interferir com a função cerebral em pacientes com doenças neurodegenerativas conhecidas como ataxias espinocerebelosas. Mas um novo estudo em moscas da fruta sugere que para pelo menos uma dessas doenças, as proteínas defeituosas podem não precisar de formar aglomerados para fazer mal.

O estudo centra-se na ataxina-7, o gene que é uma mutação em pacientes com ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA-7). Investigadores liderados pelos investigadores Jerry Workman, pH.d. e Susan Abmayr, pH.d., no Instituto Stowers para a Investigação Médica descobriram que as moscas de fruta a que falta a ataxina-7 têm neurodegeneração no cérebro e o olho — em paralelo com os efeitos da doença humana. "A suposição tem sido de que a doença é causada por proteínas agregadas", diz Workman. "Mas na mosca mutante, não há proteínas agregadas. Não há nenhuma proteína solúvel. Não existe mesmo. A falta de ataxina-7 causa neurodegeneração na mosca da fruta."

Workman e Abmayr não se propuseram a estudar a ataxina-7. Por mais de uma década, a equipa de marido e mulher investigaram como um grande complexo de proteínas chamado SAGA, que ajuda a controlar a atividade genética em organismos até aos humanos, influencia os processos de desenvolvimento. O laboratório de Workman descobriu o complexo na levedura na década de 1990. Em moscas da fruta, cerca de 20 proteínas diferentes reúnem-se para formar SAGA, que modifica o empacotamento do ADN de várias maneiras para influenciar a atividade de milhares de genes.

Quando Vikki Weake, pH.d., uma antiga investigadora de pós-doutoramento no laboratório de Workman, começou a investigar os componentes da mosca da fruta do complexo SAGA, ela descobriu uma proteína que anteriormente não tinha sido estudada nas moscas de fruta. O investigador de pós-doutoramento Ryan Mohan, pH.d., focou a sua atenção nessa proteína e através dos resultados de bases de dados genéticos, descobriu uma semelhança com a ataxina-7 humana.

A ataxina-7 é um de vários genes associados a doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Huntington e outras ataxias espinocerebelosas. Estes genes às vezes desenvolvem uma “gaguez” genética na qual um segmento de três letras do código de ADN é repetido várias vezes. "Não se sabe como isso afeta a atividade da proteína," diz Abmayr. "Mas o que se sabe é que pode causar agregação." A expansão no código genético leva a proteínas contendo cadeias longas e redundantes de um único aminoácido chamado glutamina, explica. Estas proteínas anormais são propensas a agregar uma com a outra, no interior das células.

A ataxina-7 era conhecida por se agregar nas células dos pacientes com SCA-7, mas não havia nenhuma evidência direta ligando os agregados à neurodegeneração. Então, quando a equipa se deparou com uma versão da ataxina-7 em moscas da fruta, viram uma oportunidade para aprender mais.

Mohan diz que a maioria dos estudos sobre as ataxinas e proteínas relacionadas tinham-se centrado sobre os efeitos das versões expandidas poliglutamina, em vez da função das proteínas inalteradas. "Pensei que isso era parte de um complexo de proteínas maior que regulava muitos, muitos genes, e eu pensei que era importante descobrir o que a proteína normalmente faz para regular o complexo", diz ele. "A partir dessa posição, eu poderia considerar como uma inserção poliglutamina poderia perturbar essas funções."

Mohan realizou detalhadas análises bioquímicas para entender melhor como a perda de ataxina-7 afeta o complexo SAGA. As suas experiências mostraram que a ataxina-7 âncora um dos módulos enzimáticos do complexo, que é responsável pela remoção de marcadores químicos chamados ubiquitina de embalagens de proteínas do ADN. Sem a ataxina-7, este módulo cai fora do complexo. Por conta própria, o módulo solto torna-se hiperativo, removendo demasiados marcadores ubiquitina. Isto pode levar a uma desregulação genética. Os cientistas estão a planear novas experiências para descobrir quais os genes que são afetados quando a ataxina-7 pára de funcionar.

De seguida, Mohan geneticamente criou moscas sem qualquer ataxina-7. Sem a proteína, a maioria das moscas morreram ainda embriões. Aquelas que sobreviveram até à idade adulta tinham problemas de movimento, demonstrados pela sua incapacidade de escalar. Quando os cientistas olharam para a estrutura dos neurónios no cérebro e os olhos dos insetos, eles viram que enquanto o tecido em moscas muito jovens era mais ou menos intacto, os problemas desenvolveram-se rapidamente. "Inicialmente elas até que estão bem, mas depois de alguns dias vemos degeneração maciça no cérebro e o olho,", explica Abmayr. Efeitos similares foram vistos em moscas cujo gene da ataxina-7 foi desligado apenas nas células do cérebro e olhos. A neurodegeneração que os cientistas observaram foi semelhante ao que outros investigadores tinham encontrado em moscas produzindo uma proteína ataxina-7 humana com expansão poliglutamina.

"Isto lança uma nova luz sobre o que pensamos que poderia ser a causa do fenótipo da doença SCA7," diz Abmayr. "Os problemas associados com a doença podem ser porque estas poliglutaminas realmente derrotam a função da proteína ataxina-7".

A mosca da fruta tem o potencial para revelar mais sobre o papel da ataxina-7 na doença, dizem os cientistas, que estão a planear criar uma mosca mutante cuja ataxina-7 contenha uma expansão poliglutamina. "Esperemos que, com uma combinação de bioquímica e genética, possamos descobrir quanto da neurodegeneração vem do fato de não se ter a proteína ataxina-7 normal, e quanto é por causa da proteína agregada”, diz Abmayr.

Fonte: http://medicalxpress.com/news/2014-01-fruit-flies-reveal-function-gene.html