Por Leck, Su-Ling
A ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), também conhecida como a doença de Machado-Joseph, é proposta ser a ataxia autossómica dominante mais comum. É uma doença neurodegenerativa progressiva e fatal sem cura conhecida. A proteína ataxina-3, que é expressa de forma ubíqua no cérebro, inicia o início precoce da SCA3 com uma expansão da poliglutamina (poli-Q) dentro da proteína. A ataxina-3 não expandida (não patogénica) tem um limiar de repetição poli-Q entre 12-46 resíduos, enquanto a expansão da doença coincide com 51 resíduos e acima. A característica patológica da SCA3 é a presença de inclusões nucleares da ataxina-3 agregada, co-localizadas com fragmentos da ataxina-3, ubiquitina e outras proteínas que interagem. A agregação da ataxina-3 é mais complexa do que muitas outras proteínas mal dobradas que estão associadas a doenças neurodegenerativas (ND). Tem sido demostrado que sofre uma via de agregação de dois estádios, que se refere ao domínio Josephino e ao comprimento do trato poli-Q. Além disso, também foi bem documentado que a agregação da ataxina-3 pode ser modulada por um número de parceiros ou fatores que interagem. Por conseguinte, esta tese procurou investigar a inter-relação entre o comprimento do trato poli-Q e os efeitos de uma gama de fatores e moduladores na agregação da ataxina-3, incluindo fragmentos da ataxina-3 gerados por clivagem proteolítica e também aias químicas. A clivagem proteolítica tem sido implicada no desenvolvimento de fragmentos tóxicos que iniciam a agregação em proteínas associadas a ND. Uma vez que a ataxina-3 mostrou ser um substrato para a protease, a calpaína-2, foi investigado o possível papel de fragmentos tóxicos da ataxina-3 (isto é, a hipótese do fragmento tóxico), juntamente com uma investigação sobre se a ataxina-3 da poli-Q expandida leva a uma taxa mais rápida de proteólise. Além disso, os osmolitos ou "aias químicas" têm sido cada vez mais utilizados no estudo da dobragem e agregação das proteínas. Foi demonstrado que o osmolito, trimetil-N-óxido (TMAO) reduz a dobragem incorreta de proteínas, estabilizando conformações nativas e, em particular, reduzindo a agregação de fragmentos da ataxina-3 expressos em células cultivadas. Assim, a modulação da agregação da ataxina-3 utilizando uma gama de variantes da ataxina-3 na presença de TMAO foi também explorada. Em geral, os resultados demonstraram que a calpaína-2 clivou todas as variantes da ataxina-3 (comprimento poli-Q de 15, 28, 50, 64 resíduos), uma vez que os locais de clivagem da ataxina-3 estavam principalmente localizados após o domínio Josephino. A proteólise de variantes da ataxina-3 pela calpaína-2 foi analisada cineticamente e verificou-se que a taxa de proteólise era independente do comprimento do trato poli-Q. Subsequentemente, expressou-se um fragmento da ataxina-3 contendo poli-Q com C-terminal, nomeadamente (242Q15) e (242Q64) como uma proteína de fusão recombinante e purificou-se. A agregação de ambas as proteínas de fusão e fragmento foi analisada in vitro. Determinou-se que os fragmentos (242Q15) e (242Q64) têm uma alta propensão para se agregar. É importante notar que o resultado de que ambos os fragmentos podem acelerar a agregação da ataxina-3 (Q64) de comprimento total para formar agregados insolúveis em SDS, confirma a hipótese do fragmento tóxico como um mecanismo abrangente para a doença induzida pela ataxina-3. Por fim, os comprimentos não patológicos e patológicos da ataxina-3 rapidamente se agregaram na presença de TMAO. De forma intrigante, a atividade de-ubiquitinante da ataxina-3 também foi reforçada com TMAO. Tomados em conjunto, os dados nesta tese fornecem uma visão mais profunda sobre a influência de moduladores na agregação da ataxina-3, o que pode beneficiar o desenvolvimento de terapêuticas potenciais na segmentação de agregação de proteínas na patogénese da SCA3.
(artigo traduzido)
