Faggiano,
Serena; Menon, Rajesh P.; Kelly, Geoff P .; McCormick, John; Todi, Sokol V .;
Scaglione, K. Mateus; Paulson, Henry L .; Pastore, Annalisa
Resumo
A ubiquitinação da proteína ocorre através da formação de
uma ligação isopéptida entre a glicina terminal-C da ubiquitina (Ub) e o grupo ɛ-amino
de um resíduo de substrato de lisina. Esta modificação pós-translacional, que
ocorre através da ligação de uma única e/ou múltiplas cópias de mono-ubiquitina
e cadeias de poli-ubiquitina, está envolvida em eventos cruciais celulares,
tais como a degradação das proteínas, a regulação do ciclo celular e a
reparação do ADN. O funcionamento anormal das vias de ubiquitina também está
implicado na patogénese de várias doenças humanas que variam de cancro a
neurodegeneração. No entanto, apesar da indubitável importância biológica, a
compreensão da base molecular de como a ubiquitinação regula diferentes vias
tem até agora sido fortemente limitada pela dificuldade de produzir as
quantidades de amostras altamente homogéneas que são necessárias para uma
caracterização estrutural por cristalografia de raios-X e/ou RMN (ressonância
magnética nuclear). Aqui, nós relatamos sobre a produção de miligramas de alta
pureza Josefino mono-ubiquitinadas em lisina 117 através da ubiquitinação
enzimática in vitro em grande escala. Josefino é o domínio catalítico de
ataxina-3, uma proteína responsável pela ataxia espinocerebelosa tipo 3. A ataxina-3
é a primeira enzima deubiquitinatina (DUB) relatada a ser ativada por
mono-ubiquitinação. Nós demonstramos que as amostras produzidas com o método
descrito são corretamente dobradas e adequadas para estudos estruturais. O
protocolo permite a fácil etiquetagem seletiva dos componentes. Os nossos
resultados fornecem uma prova de conceito importante que pode abrir o caminho a
novas abordagens para o estudo in vitro de proteínas ubiquitinadas.
