CRISPR tratam doença genética em mamífero adulto

Charles Gersbach, professor associado de engenharia biomecânica 

Os investigadores usaram as CRISPR para tratar um rato adulto modelo de distrofia muscular de Duchenne. Esta é a primeira vez que as CRISPR trataram com sucesso uma doença genética dentro de um mamífero vivo totalmente desenvolvido com uma estratégia que tem o potencial de ser traduzido para terapia humana.

Investigadores da Universidade Duke (NC, EUA) tinham usado anteriormente as CRISPR para corrigir mutações genéticas em células cultivadas a em pacientes com Duchenne, e outros laboratórios tinha corrigido genes em embriões de uma única célula num ambiente de laboratório. Mas a última abordagem não é atualmente ética para tentar nos seres humanos, e a primeira enfrenta muitos obstáculos na entrega de células tratadas de volta aos tecidos musculares.

Outra abordagem, que envolve levar as CRISPR diretamente aos tecidos afetados através de técnicas de terapia genética, também enfrenta desafios, particularmente com a entrega. No novo estudo, investigadores da Universidade Duke superaram vários desses obstáculos por meio de um portador não-patogénico chamado vírus adeno-associado, ou AAV, para entregar o sistema de edição genética.

O trabalho aparece no número de 31 de dezembro de 2015 na revista Science.

"As recentes discussões sobre o uso das CRISPR para corrigir mutações genéticas em embriões humanos tem justamente gerado preocupação considerável sobre as implicações éticas de tal abordagem", disse Gersbach, professor associado de engenharia biomédica na Universidade Duke. "Mas usar as CRISPR para corrigir mutações genéticas nos tecidos afetados de pacientes doentes não está em debate. Esses estudos mostram um caminho onde isso é possível, mas ainda há uma quantidade considerável de trabalho a fazer."

A distrofia muscular de Duchenne é causada por problemas com a capacidade do organismo em produzir distrofina, uma proteína de cadeia longa que liga o interior de uma fibra muscular à sua estrutura de suporte circundante. A distrofina é codificada por um gene que contém 79 regiões codificantes de proteínas, chamadas exões. Se qualquer exão recebe uma mutação debilitante, a cadeia não é construída.

Sem a distrofina a providenciar apoio, o músculo tende a rasgar-se e a deteriorar-se lentamente.

A Duchenne afeta um em cada 5.000 recém-nascidos do sexo masculino. A maioria dos pacientes está confinada a uma cadeira de rodas pelos 10 anos de idade em cadeira e não vivem além dos 20 ou 30 anos. A mutação é no cromossoma X, assim as crianças do sexo feminino com dois cromossomas X devem ter pelo menos uma cópia do gene em funcionamento.

Gersbach tem trabalhado em potenciais tratamentos genéticos para a Duchenne com vários sistemas de alteração genética desde o início do seu laboratório na Duke, em 2009. O seu laboratório recentemente começou a concentrar-se numa versão modificada CRISPR/Cas9 dum sistema de defesa bacteriano que visa e corta a parte do ADN de vírus invasores familiares.

Enquanto Gersbach tem tido sucesso em células cultivadas de pacientes usando um choque de eletricidade para fazer furos nas suas membranas para entregar o sistema CRISPR, esta estratégia não era prática em tecidos musculares do paciente.

"Um grande obstáculo para a edição genética é a entrega. Nós sabemos o que genes precisam para ser corrigidos em certas doenças, mas ter as ferramentas de edição genética onde são precisas é um enorme desafio", disse Chris Nelson, o colega no laboratório de Gersbach que liderou o trabalho. "A melhor maneira que temos de fazer isso agora é tirar proveito dos vírus, porque gastaram biliões de anos de evolução para descobrir como obter os seus próprios genes virais em células."

Nelson e Gersbach começaram a trabalhar na embalagem de ferramentas de edição genética em vírus AAV - o vírus mais popular para a entrega de genes atualmente. Foram auxiliados através de colaborações com especialistas em AAV, Aravind Asokan, professor associado na Faculdade de Medicina Chapel Hill da Universidade da Carolina do Norte (EUA) e Dongsheng Duan na Faculdade de Medicina na Universidade do Missouri (EUA). Duan também proporcionou uma experiência significativa de uma longa história de trabalho em terapia genética para doenças neuromusculares.

Para usar os vírus como veículos de entrega para a terapia genética, os investigadores levam todos os genes nocivos e replicativos para fora do vírus e colocam genes terapêuticos que querem entregar. Enquanto tipos de vírus precoces não funcionaram bem por várias razões, tais como a integração no genoma e causando problemas ou desencadeando respostas imunes, o AAV, até agora, provou ser especial. É um vírus a que muitas pessoas estão expostas de qualquer maneira e não é patogênico, mas ainda extremamente eficaz no sentido de conseguir entrar nas células.

O AAV é utilizado em diversos ensaios clínicos de fase tardia nos EUA, e que já foram aprovados para utilização num fármaco de terapia genética na União Europeia. Há também diferentes versões do AAV que podem preferencialmente ir para diferentes tecidos, como músculos esqueléticos e cardíacos, por isso os investigadores podem entregá-los sistematicamente.

Mas há sempre um senão, e para Gersbach era uma questão de tamanho.

"O AAV é um vírus muito pequeno e as CRISPR são relativamente grandes", disse Gersbach. "Simplesmente não encaixa bem, portanto, ainda tínhamos um problema de embalamento."

A solução veio de Feng Zhang, um investigador no Instituto Broad do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e Harvard (EUA). No início de 2015, Zhang descreveu um sistema CRISPR duma bactéria diferente do que a comumente usada.

No sistema imune natural bacteriano, as CRISPR é o tiro certeiro que ajuda a identificar o ADN visado, e a Cas9 é a lâmina que corta os fios. A proteína Cas9 grande que é tipicamente usada por investigadores vem das espécies bacterianas Streptococcus pyogenes. Depois de vasculhar o reino bacteriano, Zhang descobriu a proteína muito menor Cas9 de Staphylococcus aureus.

Pequena o suficiente para caber confortavelmente dentro do AAV.

No estudo, os investigadores trabalharam com um rato modelo que tem uma mutação debilitante num dos exões do gene da distrofina. Programaram o novo sistema CRISPR/Cas9 para cortar o exão disfuncional, deixando o sistema de reparação natural do corpo para costurar o gene remanescente de volta junto para criar uma versão do gene mais curta, mas funcional.

Além de ser muito mais fácil e mais eficiente do que a substituição do exão disfuncional por uma cópia que trabalha, simplesmente cortando fora o elo mais fraco é uma estratégia que seria eficaz numa faixa maior da população paciente.

Gersbach e a sua equipa primeiro usaram a terapia diretamente num músculo da perna num rato adulto, resultando na restauração da distrofina funcional e num aumento da força muscular. Injetaram então a combinação CRISPR/AAV na corrente sanguínea dum rato para chegar a todos os músculos. Os resultados mostraram alguma correção dos músculos por todo o corpo, inclusive o coração - uma grande vitória, porque a insuficiência cardíaca é muitas vezes a causa de morte de pacientes com Duchenne.

"Ainda há uma quantidade significativa de trabalho a fazer para traduzir isto para a terapia humana e demonstrar a segurança", disse Gersbach. "Mas estes resultados provenientes das nossas primeiras experiências são muito emocionantes. A partir daqui, vamos estar a otimizar o sistema de entrega, avaliando a abordagem em modelos mais graves de DMD, e a avaliar a eficiência e a segurança em animais maiores com o eventual objetivo de entrar em ensaios clínicos."

CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, ou Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas

(artigo traduzido)

Fonte: http://medicalxpress.com/news/2015-12-crispr-genetic-disorder-adult-mammal.html